«Чудо-яд» для новых лекарств

актуальность

Протеазы, которые в определенной последовательности расщепляют белковые мишени, контролируют многочисленные биологические функции. Поэтому возможность репрограммирования их функциональной способности для разрушения выборочно необходимых аминокислотных последовательностей открывает новые пути терапевтического и биотехнологического применения этих ферментов. В новом исследовании, представленном учеными под руководством сотрудников Института трансформационных технологий в здравоохранении Р. Меркина (Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare), США и Гарвардского университета (Harvard University), США, сообщается о метод лабораторной эволюции протеаз, который имеет потенциал терапевтического применения [1].

Указанный метод позволяет ускорить изменения протеаз, которые «разрезают» новые белковые последовательности и теряют свою способность расщеплять нецелевые фрагменты. Используя эту технологию, разработаны протеазы нейротоксина ботулина — важный класс ферментов, которые могут применяться у пациентов для выборочного разрушения новых мишеней, включая белки, первично не связаны с этими протеазами. Итак, метод представляет потенциально новый терапевтический подход — применение протеаз с индивидуальной специфичностью. Материалы работы опубликованы в журнале «Science» 19 февраля 2021

Дизайн исследования и практическое воплощение результатов

Общеизвестно, что ботулотоксин — «чудо-яд» — ранее был одобрен Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (Food and Drug Administration) для терапии у пациентов с различными состояниями, в частности хронической мигренью, мышечными спазмами и т.д. [2, 3]. В новом исследовании впервые доказана возможность быстрого лабораторного синтеза токсина для воздействия на различные белки. Это достигается созданием набора высокоселективных протеаз, которые могут способствовать нейрорегенерации, регулировать активность ростовых факторов, подавлять неконтролируемое воспаление или ослаблять гиперреактивность иммунного ответа, так называемый цитокиновый шторм.

Исследовательскую работу было сосредоточено на решении двух основных задач. Прежде всего, успешно осуществлено перепрограммирования протеаз. Это позволило ферментировать совершенно новые белковые мишени, которые иногда даже не похожи на нативные мишени выходных протеаз. Кроме того, начато решение вопроса «классического вызова биологии»: разработка внутриклеточной технологии лечения. В отличие от большинства высокомолекулярных белков, протеазы ботулотоксина в большом количестве могут проникать в нейроны, позиционирует их как потенциальные лечебные средства. На этом этапе работы основным достижением стало программирования индивидуальных протеаз с индивидуальными инструкциями относительно выделения белков.

Указанная возможность позволяет редактировать геном, одновременно дополняя сейчас имеющиеся технологии в этой сфере. Современные технологии редактирования генома направлены, прежде всего, на коррекцию этиологического фактора при хронических заболеваниях (например серповидноклеточная анемия, обусловленная первичным генетическим дефектом). Однако некоторые острые заболевания, в частности неврологические нарушения после перенесенного инсульта, является следствием генетических ошибок. И в подобных случаях терапия протеазами на клеточном уровне может помочь повысить способность организма преодолевать функциональные изменения, вызванные поражением нервных структур.

Десятилетиями ученые стремились использовать протезы в лечении заболеваний. В отличие от антител, которые способны атаковать только определенные чужеродные соединения в организме, протеазы могут находить и прикрепляться к любым протеинов, а после связывания — реализовать больше полезных возможностей, чем просто уничтожать свою мишень. Например, протеазы способны реактивировать «спящие» белки. Однако вопреки этим важным функциональным характеристикам эти ферменты до сих пор не нашли широкого применения как терапевтические средства в лечении человека, и, прежде всего, благодаря отсутствию методов разработки создания протеаз, которые расщепляют специфические выбранные мишени.

Однако новая технология на основе продолжающейся эволюции, опосредованной фагами (phage-assisted continuous evolution — PACE) успешно преодолевает указанные препятствия. Эта клеточная платформа обеспечивает непрерывное развитие новых белков с ценными функциональными свойствами. По словам авторов, технология PACE способна создавать десятки поколений протеинов в сутки при минимальном вмешательстве человека. Так, используя PACE, учеными сначала было перепрограммирован хаотические протеазы на путь большей избирательности, после чего направлен их активность на распознавание совершенно новых мишеней, которые являются вне их первичной компетенции. С помощью платформы PACE осуществлено эволюцию четырех протез из трех семейств ботулотоксина. В каждой из четырех протеаз не обнаружено активности в отношении их первичных мишеней, при этом они приобрели способность ограничивать свои новые мишени с высоким уровнем специфичности — в диапазоне от 218 до более чем 11000000 раз. В то же время протеазы сохраняли свою способность проникать в клетки.

практические выводы

По ожиданиям авторов, создана технология может стать мощным инструментом лечения на клеточном уровне. Действительно, PACE обеспечивает прочную основу для быстрой эволюции протеаз с новыми возможностями, но реализация клинического применения такого инструмента клеточной терапии требует будущей кропотливой работы. В то же время авторы обозначили имеющиеся ограничения: белки не являются идеальными кандидатами в лечении хронических заболеваний, ведь со временем иммунная система организма идентифицирует их как чужеродные объекты, атакует и обезвреживает. Несмотря на то что продолжительность персистенции ботулотоксина в клетках сравнительно длинной (до 3 мес в отличие от типичного жизненного цикла белков, составляет часы или дни), эволюционно измененные белки могут отличаться короткой продолжительностью жизни, закономерно снижает их эффективность. Тем не менее, для идентификации чужеродных соединений иммунная система организма требует времени. Поэтому протеазы могут стать эффективным инструментом временного лечения. С этой целью исследователи планируют продолжить поиск путей предотвращения иммунного ответа, изучая другие классы протеаз млекопитающих, ведь организм с более низкой вероятностью атакует белки, похожие на их собственные.

Список использованной литературы:

1. Blum TR, Liu H., Packer MS et al. (2020) Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity. Science, 371 (6531): 803-810. Doi: 10.1126 / science.abf5972.
2. Kostrzewa RM, Kostrzewa RA, Kostrzewa JP (2015) Botulinum neurotoxin: Progress in negating its neurotoxicity; and in extending its therapeutic utility via molecular engineering. MiniReview. Peptides, 72: 80-87. doi: 10.1016 / j.peptides.2015.07.003.
3. Masuyer G., Zhang S., Barkho S. et al. (2018) Structural characterisation of the catalytic domain of botulinum neurotoxin X — high activity and unique substrate specificity. Sci Rep., 8 (1): 4518. doi: 10.1038 / s41598-018-22842-4.

Н.А. Савельева-Кулик,
Редакция журнала «Украинский медицинский журнал»